MENYIAPKAN BAHAN STERILISASI

 

A.        Pengetahuan yang Diperlukan dalam Menyiapkan Bahan Sterilisasi

Kultur jaringan meliputi penanaman sel atau agregat sel, jaringan, dan organ tanaman pada medium yang mengandung gula, vitamin, asam-asam amino, garam-garam anorganik, air, zat pengatur tumbuh, dan bahan pemadat. Komposisi medium tumbuh ternyata sangat menguntungkan pula bagi pertumbuhan cendawan dan bakteri. Bila diberi kesempatan maka mikroorganisme tersebut akan tumbuh dengan cepat dan dalam waktu singkat akan menutupi permukaan medium serta eksplan yang akan ditanam. Selanjutnya, organisme tersebut akan menyerang eksplan melalui luka-luka akibat pemotongan dan penanganan pada saat sterilisasi sehingga mengakibatkan kematian eksplan. Disamping itu, beberapa jenis mikroorganisme melepaskan senyawa beracun ke dalam medium kultur yang dapat menyebabkan kematian jaringan. Oleh karena itu, dalam inisiasi suatu kultur yang aksenik, artinya kultur hanya dengan satu macam organisme yang diinginkan (dalam hal ini jaringan tanaman).

 

Beberapa sumber kontaminan mikroorganisme pada sistem kultur jaringan dapat dikemukakan sebagai berikut:

a.    Medium sebagai akibat proses sterilisasi yang tidak sempurna.

b.    Lingkungan kerja dan pelaksanaan penanaman yang kurang hati-hatidan kurang teliti.

c.    Eksplan.

d.    Secara internal (kontaminan terbawa di dalam jaringan).

e.    Secara eksternal (kontaminan berada di permukaan eksplan) akibat prosedur sterilisasi yang kurang sempurna.

f.     Dari serangga atau hewan kecil yang berhasil masuk ke dalam botol kultur setelah diletakkan di dalam ruang kultur ataupun ruang stok.

 

Dari semua sumber kontaminasi, yang paling sulit diatasi adalah yang berasal dari eksplan. Oleh karena itu, dalam memilih suatu metode sterilisasi haruslah selektif, kita hanya mengeliminasi jamur atau bakteri yang tidak diinginkan dengan gangguan seminimal mungkin terhadap bahan eksplan.

 

Untuk menghilangkan sumber infeksi, bahan eksplan haruslah disterilkan sebelum ditanamkan pada medium tumbuh. Jaringan ataupun organ yang terinfeksi jamur atau bakteri sistemik hendaknya dibuang.

 

Sterilisasi eksplan merupakan salah satu prosedur yang digunakan untuk menghilangkan kontaminan mikroorganisme pada eksplan. Pemeliharaan suci hama dan penyakit (keaseptikan) atau kondisi steril sangat esensial untuk keberhasilan dalam prosedur kultur jaringan. Keadaan aseptis ini diperlukan untuk semua botol kultur yang akan digunakan, media kultur, peralatan yang akan digunakan dalam kegiatan penanaman eksplan. Selain itu eksplan yang akan dikulturkan pada media kultur itu sendiri harus steril yang berarti bebas dari berbagai agen/sumber kontaminan hidup. Oleh karena itu tahap sterilisasi sering menjadi kendala utama keberhasilan perbanyakan tanaman secara kultur jaringan. Kontaminan hidup dapat berupa cendawan, bakteri, tungau, serangga dan telurnya. Apabila kontaminan tersebut tidak dihilangkan maka pada media yang mengandung gula, vitamin dan mineral dalam waktu singkat akan dipenuhi kontaminan sehingga mengakibatkan eksplan menjadi mati.

 

Prosedur di bawah ini dalam praktiknya sering dilakukan dengan berbagai modifikasi, disesuaikan dengan jenis eksplan, tingkat kelunakan jaringan, dan kandungan kontaminan pada eksplan yang digunakan. Prosedur sterilisasi permukaan eksplan yang sering digunakan diuraikan sebagai berikut:

a.    Eksplan yang diambil dari tanaman induk dicuci di bawah air keran yang mengalir dengan diberi sedikit detergen yang gmembersihkan kotoran yang melekat di permukaan terluar eksplan.

b.    Eksplan (batang berbuku, daun muda, empulur batang, umbi batang, dan umbi akar) dipotong-potong menjadi bagian yang keci, sekitar 0,5 – 2 cm.

c.    Eksplan yang sudah dipotong-potong, dicuci lagi dengan air keran. Untuk mencegah pencokelatan di permukaan, eksplan dapat juga direndam dalam larutan berisi 50 mg/1 asam sitrat dan 150 mg/l asam askorbat sebagai antioksidan .

d.    Khusus untuk tanaman berkayu, eksplan biasanya dicelupkan ke dalam alkohol 70% selama beberapa detik. Tujuannya untuk menghilangkan gelembung udara, meningkatkan daya antar desinfektan, sekaligus mematikan sebagian kontaminan di permukaan eksplan.

e.    Eksplan direndam-dikocok dalam larutan NaOCl 0,5 – 1% dan dua tetes Tween-20 per 100 ml selama 5 – 20 menit. Dapat juga eksplan dimasukkan ke dalam wadah berisi larutan NaOCl yang dilengkapi dengan penyedotan vakum selama 5 – 20 menit.

f.     Jika tingkat kontaminasinya terlalu tinggi, perendam-kocokan dalam larutan NaOCl sebaiknya diulang dengan konsentrasi larutan yang lebih rendah dan dengan waktu perendaman lebih singkat. Contohnya, jika perendaman pertama dilakukan dalam larutan pemutih pakaian 20% (NaOCl) selama 15 menit, perendaman kedua sebaiknya dilakukan dalam larutan pemutih pakaian berkonsentrasi 5 – 10% selama 5 – 10 menit.

g.    Eksplan dibilas tiga kali dengan air steril (air yang sudah disterilisasi dengan autoklaf). Eksplan yang sudah dibilas dengan air steril ini sudah siap untuk ditanam.  

 

Untuk meminimalkan tingkat kontaminasi dan mendapatkan pertumbuhan eksplan yang cepat, beberapa perlakuan terhadap tanaman induk sumber eksplan dapat diterapkan sebagai berikut:

a.    Pemeliharaan tanaman induk di rumah kaca dengan pengendalian hama dan penyakit tanaman secara intensif.

b.    Pemangkasan tanaman induk diikuti dengan pemupukan yang seimbang. Flush atau trubusan baru yang tumbuh setelah pemangkasan digunakan sebagai eksplan. Flush  yang tumbuh tersebut sebaiknya disemprot dengan fungisida sistemik (Benlate) dan bakterisida (Agrept) agar tumbuhnya lebih sehat.

c.    Perlakuan tanaman induk dengan temperatur tertentu seperti dengan suhu rendah (4 ^oC) atau suhu tinggi (35 ^oC).

d.    Perlakuan tanaman induk dengan ZPT seperti sitokinin atau giberelin. Sitokinin untuk merangsang tumbuhnya tunas-tunas aksilar, sedangkan giberelin untuk merangsang pemanjangan tunas.

 

Pemeliharaan tanaman induk dalam keadaan yang lebih higienis yaitu dengan menumbuhkannya di dalam rumah kaca dengan pengendalian hama dan penyakit tanaman yang intensif terbukti dengan mengurangi tingkat kontaminasi eksplan yang diambil dari tanaman induk tersebut, terutama yang disebabkan oleh cendawan. Namun, cara ini sulit diterapkan untuk kontaminasi yang disebabkan oleh mikroorganisme endofitik, terutama bakteri.

 

Kontaminasi yang disebabkan oleh mikroorganisme endofitik (mikroorganisme yang hidup di dalam sel atau ruang antarsel tanaman) yang sering merupakan biota dari tanaman sumber eksplan, sulit diatasi dengan sterilisasi permukaan. Keadaan ini diakibatkan koloni bakteri sering tidak muncul pada saat eksplan baru dikulturkan pertama kali, tetapi beberapa minggu kemudian muncul koloni bakteri. Bakteri tersebut tetap ada setelah disbukulturkan berkali-kali, karena hidupnya memang secara epifit di dalam jaringan tanaman.

 

Selanjutnya, cara-cara yang sering digunakan untuk mengatasi kontaminasi kultur yang persisten sebagai berikut:

a.    Pencucian ulang dengan sodium hipoklorit konsentrasi rendah, seperti menggunakan pemutih pakaian 5% (setara dengan 0,25% NaOCl). Pembuatannya dilakukan dengan cara melarutkan 5 ml pemutih pakaian dan 95 ml aquades.

b.    Penggunaan media yang mengandung antibiotik.

c.    Penggunaan eksplan berukuran sekecil mungkin seperti meristem dengan beberapa primordia daun.

d.    Pemotongan bagian teratas eksplan yang telah tumbuh. Bagian atas saja yang disubkulturkan, sedangkan bagian bawahnya dibuang atau diaklimatisasi. Kegiatan ini dilakukan secara berulang-ulang hingga kontaminasi teratasi.

 

Beberapa penelitian menganjurkan penggunaan campuran antibiotik sebagai berikut:

a.    25 mg/ml cefotaksim + 25 mg/ml tetrasiklin + 6 mg/ml rifampisin + 6 mg/ml polymixin B.

b.    20 mg/ml rifampisin + 20 mg/ml trimethoprim.

c.    20 mg/ml gentamisin + 20 mg/ml kanamisin + 30 mg/ml khlor-tetrasiklin + 60 mg/ml khloramfenikol + 75 mg/ml rifampisin + 750 mg/l benomil.

 

B.   Fungsi Bahan sterilisasi

Sterilisasi eksplan dengan bahan sterilisasi adalah sebatas membersihkan debu, cendawan, bakteri dan kontaminan lain dari bagian permukaan eksplan atau disebut dengan desinfestasi. Ada berbagai macam bahan sterilisasi yang memiliki interval konsentrasi penggunaan, waktu sterilisasi dan fungsi berbeda-beda. Pemilihan bahan sterilisasi untuk setiap eksplan perlu diketahui terlebih dahulu apakah kontaminannya berupa kontaminan eksternal atau kontaminan internal. Bahan tanam yang mengandung kontaminan eksternal dipilih bahan sterilisasi yang dapat membersihkan permukaan luar eksplan. Sedangkan pada eksplan yang mengandung kontaminan internal yaitu kontaminan yang berasal dari jaringan tanaman itu sendiri perlu diberi perlakuan antibiotik atau fungisida dan bakterisida sistemik. Berbagai bahan sterilisasi eksplan, konsentrasi, waktu dan fungsinya tercantum pada tabel di bawah ini.

 

Tabel 1.    Bahan Sterilisasi Eksplan, Konsentrasi, Waktu Sterilisasi dan Fungsinya

Bahan Sterilisasi	Penggunaan	Waktu Sterilisasi	Fungsi
Detergen	Secukupnya	Secukupnya	Membersihkan kotoran dan getah eksplan
Fungisida	2 gram/liter	30 menit	Sterilisasi eksplan dari cendawan
Bakterisida	2 gram/liter	30 menit	Sterilisasi eksplan dari bakteri
Alkohol	70 - 95 %	1-5 menit	Desinfektan
Sodium hipoklorit (Clorox)	5 - 30 %	5-30 menit	Desinfektan
Mercury khlorida (Sublimat)	0,01 - 0,1 %	2-10 menit	Desinfektan
Tween-20	1 - 3 tetes	Secukupnya	Agen pembasah
Antibiotik	Sesuai dosis	Secukupnya	Anti bakteri dan jamur
Iodine	10 %	15-30 menit	Antiseptik

 

Teknik sterilisasi yang digunakan untuk sterilisasi eksplan harus selektif dalam pemilihannya. Hal ini bertujuan agar bahan sterilisasi yang digunakan dapat sesuai dengan jenis eksplannya. Setiap eksplan mempunyai tingkat kontaminan permukaan yang berbeda, tergantung jenis tanamannya, bagian tanaman yang dipergunakan, morfologi permukaan (misalnya : berbulu atau tidak), lingkungan tumbuh (green house atau lahan), musim waktu mengambil (musim hujan atau kemarau), umur tanaman (seedling atau tanaman dewasa) dan kondisi tanaman (sakit atau sehat).

 

Bahan-bahan sterilisasi yang dapat digunakan untuk sterilisasi bahan tanaman sudah banyak tersedia. Larutan hipoklorit (natrium ataupun kalsium) telah terbukti efektif pada kebanyakan bahan tanaman. Misalnya, perlakuan Na-hipoklorit 0,3 – 0,6% selama 15 – 30 menit terbukti efektif untuk sterilisasi sebagian besar bahan tanaman. Perlu diingat, bahan sterilisasi bersifat meracuni jaringan. Oleh karena itu, tingkat konsentrasi dan lamanya perlakuan harus benar-benar diperhatikan untuk mengurangi resiko kematian jaringan.

 

Penggunaan merkuri klorida (HgCl₂) telah terbukti efektif untuk sterilisasi bahan tanaman yang berasal dari lapangan. Meskipun demikian, penggunaan HgCl₂ merupakan pilihan terakhir jika bahan-bahan lain ternyata tidak mampu untuk memusnahkan mikroorganisme yang menginfeksi bahan tanaman. Hal itu dikarenakan sifat senyawa tersebut sangat beracun sehingga memerlukan penanganan yang sangat hati-hati. Jika menggunakan HgCL₂, sisa larutannya harus dikumpulkan dalam satu wadah kemudian dibuang di suatu tempat yang tidak akan mencemarkan sumber air minum.

 

Pada umumnya, jika eksplan yang digunakan agak keras dan cukup besar maka dapat segera disterilisasi dengan disinfektan. Pada kultur biji atau endosperm dewasa tanaman Euphorbiaceae, sterilisasi dilakukan terhadap seluruh biji atau biji-biji yang dikupas. Bila ovul, embrio, atau endosperm muda yang akan dikulturkan maka metode yang dipakai adalah mensterilkan ovari ataupun ovul dan mengambil eksplan di bawah kondisi aseptik sehingga jaringan inokulum yang lunak terlindungi dari pengaruh bahan sterilisasi yang bersifat racun. Sama halnya dengan kultur anther, tunas bunga disterilkan dan eksplan anther diisolasi secara aseptik.

 

Bahan sterilan cair perlu diperhatikan konsentrasinya dalam penggunaannya, sementara bahan sterilisasi padat perlu dilakukan penimbangan beratnya dan perlu dilarutkan terlebih dahulu ke dalam aquades steril sehingga dapat diperoleh sejumlah konsentrasi yang sesuai dengan ketentuan dalam proses sterilisasi eksplan (g/ml). Diketahui bahan sterilan yang perlu dilakukan penimbangan adalah fungisida, bakterisida, HgCl₂ dan Ca-hipoklorit.

Contoh:

a.    Fungisida dan bakterisida

- timbang bahan sebanyak 0,2 g

- larutkan dengan air steril 100 mL

- siap digunakan.

 

b.    HgCl₂

- timbang bahan sebanyak 0,05 – 0,1 g

- larutkan dengan 100 mL air steril lalu diaduk hingga larut dan merata

- tutup dengan plastik atau kertas steril (jangan menggunakan alumunium foil)

- siap digunakan.

 

c.    Ca-hipoklorit

- timbang bahan sebanyak 0,2 g

- larutkan dalam HCl 1 N secukupnya

- tambahkan air steril hingga volumenya 100 mL

- siap digunakan.

Sumber :  Modul diklat berbasis kompetensi bidang pertanian tanaman pangan, tanaman perkebunan dan hortikultura sub bidang kultur jaringan