MENYIAPKAN BAHAN STERILISASI

 

A.        Pengetahuan yang Diperlukan dalam Menyiapkan Bahan Sterilisasi

Kultur jaringan meliputi penanaman sel atau agregat sel, jaringan, dan organ tanaman pada medium yang mengandung gula, vitamin, asam-asam amino, garam-garam anorganik, air, zat pengatur tumbuh, dan bahan pemadat. Komposisi medium tumbuh ternyata sangat menguntungkan pula bagi pertumbuhan cendawan dan bakteri. Bila diberi kesempatan maka mikroorganisme tersebut akan tumbuh dengan cepat dan dalam waktu singkat akan menutupi permukaan medium serta eksplan yang akan ditanam. Selanjutnya, organisme tersebut akan menyerang eksplan melalui luka-luka akibat pemotongan dan penanganan pada saat sterilisasi sehingga mengakibatkan kematian eksplan. Disamping itu, beberapa jenis mikroorganisme melepaskan senyawa beracun ke dalam medium kultur yang dapat menyebabkan kematian jaringan. Oleh karena itu, dalam inisiasi suatu kultur yang aksenik, artinya kultur hanya dengan satu macam organisme yang diinginkan (dalam hal ini jaringan tanaman).

 

Beberapa sumber kontaminan mikroorganisme pada sistem kultur jaringan dapat dikemukakan sebagai berikut:

a.    Medium sebagai akibat proses sterilisasi yang tidak sempurna.

b.    Lingkungan kerja dan pelaksanaan penanaman yang kurang hati-hatidan kurang teliti.

c.    Eksplan.

d.    Secara internal (kontaminan terbawa di dalam jaringan).

e.    Secara eksternal (kontaminan berada di permukaan eksplan) akibat prosedur sterilisasi yang kurang sempurna.

f.     Dari serangga atau hewan kecil yang berhasil masuk ke dalam botol kultur setelah diletakkan di dalam ruang kultur ataupun ruang stok.

 

Dari semua sumber kontaminasi, yang paling sulit diatasi adalah yang berasal dari eksplan. Oleh karena itu, dalam memilih suatu metode sterilisasi haruslah selektif, kita hanya mengeliminasi jamur atau bakteri yang tidak diinginkan dengan gangguan seminimal mungkin terhadap bahan eksplan.

 

Untuk menghilangkan sumber infeksi, bahan eksplan haruslah disterilkan sebelum ditanamkan pada medium tumbuh. Jaringan ataupun organ yang terinfeksi jamur atau bakteri sistemik hendaknya dibuang.

 

Sterilisasi eksplan merupakan salah satu prosedur yang digunakan untuk menghilangkan kontaminan mikroorganisme pada eksplan. Pemeliharaan suci hama dan penyakit (keaseptikan) atau kondisi steril sangat esensial untuk keberhasilan dalam prosedur kultur jaringan. Keadaan aseptis ini diperlukan untuk semua botol kultur yang akan digunakan, media kultur, peralatan yang akan digunakan dalam kegiatan penanaman eksplan. Selain itu eksplan yang akan dikulturkan pada media kultur itu sendiri harus steril yang berarti bebas dari berbagai agen/sumber kontaminan hidup. Oleh karena itu tahap sterilisasi sering menjadi kendala utama keberhasilan perbanyakan tanaman secara kultur jaringan. Kontaminan hidup dapat berupa cendawan, bakteri, tungau, serangga dan telurnya. Apabila kontaminan tersebut tidak dihilangkan maka pada media yang mengandung gula, vitamin dan mineral dalam waktu singkat akan dipenuhi kontaminan sehingga mengakibatkan eksplan menjadi mati.

 

Prosedur di bawah ini dalam praktiknya sering dilakukan dengan berbagai modifikasi, disesuaikan dengan jenis eksplan, tingkat kelunakan jaringan, dan kandungan kontaminan pada eksplan yang digunakan. Prosedur sterilisasi permukaan eksplan yang sering digunakan diuraikan sebagai berikut:

a.    Eksplan yang diambil dari tanaman induk dicuci di bawah air keran yang mengalir dengan diberi sedikit detergen yang gmembersihkan kotoran yang melekat di permukaan terluar eksplan.

b.    Eksplan (batang berbuku, daun muda, empulur batang, umbi batang, dan umbi akar) dipotong-potong menjadi bagian yang keci, sekitar 0,5 – 2 cm.

c.    Eksplan yang sudah dipotong-potong, dicuci lagi dengan air keran. Untuk mencegah pencokelatan di permukaan, eksplan dapat juga direndam dalam larutan berisi 50 mg/1 asam sitrat dan 150 mg/l asam askorbat sebagai antioksidan .

d.    Khusus untuk tanaman berkayu, eksplan biasanya dicelupkan ke dalam alkohol 70% selama beberapa detik. Tujuannya untuk menghilangkan gelembung udara, meningkatkan daya antar desinfektan, sekaligus mematikan sebagian kontaminan di permukaan eksplan.

e.    Eksplan direndam-dikocok dalam larutan NaOCl 0,5 – 1% dan dua tetes Tween-20 per 100 ml selama 5 – 20 menit. Dapat juga eksplan dimasukkan ke dalam wadah berisi larutan NaOCl yang dilengkapi dengan penyedotan vakum selama 5 – 20 menit.

f.     Jika tingkat kontaminasinya terlalu tinggi, perendam-kocokan dalam larutan NaOCl sebaiknya diulang dengan konsentrasi larutan yang lebih rendah dan dengan waktu perendaman lebih singkat. Contohnya, jika perendaman pertama dilakukan dalam larutan pemutih pakaian 20% (NaOCl) selama 15 menit, perendaman kedua sebaiknya dilakukan dalam larutan pemutih pakaian berkonsentrasi 5 – 10% selama 5 – 10 menit.

g.    Eksplan dibilas tiga kali dengan air steril (air yang sudah disterilisasi dengan autoklaf). Eksplan yang sudah dibilas dengan air steril ini sudah siap untuk ditanam.  

 

Untuk meminimalkan tingkat kontaminasi dan mendapatkan pertumbuhan eksplan yang cepat, beberapa perlakuan terhadap tanaman induk sumber eksplan dapat diterapkan sebagai berikut:

a.    Pemeliharaan tanaman induk di rumah kaca dengan pengendalian hama dan penyakit tanaman secara intensif.

b.    Pemangkasan tanaman induk diikuti dengan pemupukan yang seimbang. Flush atau trubusan baru yang tumbuh setelah pemangkasan digunakan sebagai eksplan. Flush  yang tumbuh tersebut sebaiknya disemprot dengan fungisida sistemik (Benlate) dan bakterisida (Agrept) agar tumbuhnya lebih sehat.

c.    Perlakuan tanaman induk dengan temperatur tertentu seperti dengan suhu rendah (4 ^oC) atau suhu tinggi (35 ^oC).

d.    Perlakuan tanaman induk dengan ZPT seperti sitokinin atau giberelin. Sitokinin untuk merangsang tumbuhnya tunas-tunas aksilar, sedangkan giberelin untuk merangsang pemanjangan tunas.

 

Pemeliharaan tanaman induk dalam keadaan yang lebih higienis yaitu dengan menumbuhkannya di dalam rumah kaca dengan pengendalian hama dan penyakit tanaman yang intensif terbukti dengan mengurangi tingkat kontaminasi eksplan yang diambil dari tanaman induk tersebut, terutama yang disebabkan oleh cendawan. Namun, cara ini sulit diterapkan untuk kontaminasi yang disebabkan oleh mikroorganisme endofitik, terutama bakteri.

 

Kontaminasi yang disebabkan oleh mikroorganisme endofitik (mikroorganisme yang hidup di dalam sel atau ruang antarsel tanaman) yang sering merupakan biota dari tanaman sumber eksplan, sulit diatasi dengan sterilisasi permukaan. Keadaan ini diakibatkan koloni bakteri sering tidak muncul pada saat eksplan baru dikulturkan pertama kali, tetapi beberapa minggu kemudian muncul koloni bakteri. Bakteri tersebut tetap ada setelah disbukulturkan berkali-kali, karena hidupnya memang secara epifit di dalam jaringan tanaman.

 

Selanjutnya, cara-cara yang sering digunakan untuk mengatasi kontaminasi kultur yang persisten sebagai berikut:

a.    Pencucian ulang dengan sodium hipoklorit konsentrasi rendah, seperti menggunakan pemutih pakaian 5% (setara dengan 0,25% NaOCl). Pembuatannya dilakukan dengan cara melarutkan 5 ml pemutih pakaian dan 95 ml aquades.

b.    Penggunaan media yang mengandung antibiotik.

c.    Penggunaan eksplan berukuran sekecil mungkin seperti meristem dengan beberapa primordia daun.

d.    Pemotongan bagian teratas eksplan yang telah tumbuh. Bagian atas saja yang disubkulturkan, sedangkan bagian bawahnya dibuang atau diaklimatisasi. Kegiatan ini dilakukan secara berulang-ulang hingga kontaminasi teratasi.

 

Beberapa penelitian menganjurkan penggunaan campuran antibiotik sebagai berikut:

a.    25 mg/ml cefotaksim + 25 mg/ml tetrasiklin + 6 mg/ml rifampisin + 6 mg/ml polymixin B.

b.    20 mg/ml rifampisin + 20 mg/ml trimethoprim.

c.    20 mg/ml gentamisin + 20 mg/ml kanamisin + 30 mg/ml khlor-tetrasiklin + 60 mg/ml khloramfenikol + 75 mg/ml rifampisin + 750 mg/l benomil.

 

B.   Fungsi Bahan sterilisasi

Sterilisasi eksplan dengan bahan sterilisasi adalah sebatas membersihkan debu, cendawan, bakteri dan kontaminan lain dari bagian permukaan eksplan atau disebut dengan desinfestasi. Ada berbagai macam bahan sterilisasi yang memiliki interval konsentrasi penggunaan, waktu sterilisasi dan fungsi berbeda-beda. Pemilihan bahan sterilisasi untuk setiap eksplan perlu diketahui terlebih dahulu apakah kontaminannya berupa kontaminan eksternal atau kontaminan internal. Bahan tanam yang mengandung kontaminan eksternal dipilih bahan sterilisasi yang dapat membersihkan permukaan luar eksplan. Sedangkan pada eksplan yang mengandung kontaminan internal yaitu kontaminan yang berasal dari jaringan tanaman itu sendiri perlu diberi perlakuan antibiotik atau fungisida dan bakterisida sistemik. Berbagai bahan sterilisasi eksplan, konsentrasi, waktu dan fungsinya tercantum pada tabel di bawah ini.

 

Tabel 1.    Bahan Sterilisasi Eksplan, Konsentrasi, Waktu Sterilisasi dan Fungsinya

Bahan Sterilisasi	Penggunaan	Waktu Sterilisasi	Fungsi
Detergen	Secukupnya	Secukupnya	Membersihkan kotoran dan getah eksplan
Fungisida	2 gram/liter	30 menit	Sterilisasi eksplan dari cendawan
Bakterisida	2 gram/liter	30 menit	Sterilisasi eksplan dari bakteri
Alkohol	70 - 95 %	1-5 menit	Desinfektan
Sodium hipoklorit (Clorox)	5 - 30 %	5-30 menit	Desinfektan
Mercury khlorida (Sublimat)	0,01 - 0,1 %	2-10 menit	Desinfektan
Tween-20	1 - 3 tetes	Secukupnya	Agen pembasah
Antibiotik	Sesuai dosis	Secukupnya	Anti bakteri dan jamur
Iodine	10 %	15-30 menit	Antiseptik

 

Teknik sterilisasi yang digunakan untuk sterilisasi eksplan harus selektif dalam pemilihannya. Hal ini bertujuan agar bahan sterilisasi yang digunakan dapat sesuai dengan jenis eksplannya. Setiap eksplan mempunyai tingkat kontaminan permukaan yang berbeda, tergantung jenis tanamannya, bagian tanaman yang dipergunakan, morfologi permukaan (misalnya : berbulu atau tidak), lingkungan tumbuh (green house atau lahan), musim waktu mengambil (musim hujan atau kemarau), umur tanaman (seedling atau tanaman dewasa) dan kondisi tanaman (sakit atau sehat).

 

Bahan-bahan sterilisasi yang dapat digunakan untuk sterilisasi bahan tanaman sudah banyak tersedia. Larutan hipoklorit (natrium ataupun kalsium) telah terbukti efektif pada kebanyakan bahan tanaman. Misalnya, perlakuan Na-hipoklorit 0,3 – 0,6% selama 15 – 30 menit terbukti efektif untuk sterilisasi sebagian besar bahan tanaman. Perlu diingat, bahan sterilisasi bersifat meracuni jaringan. Oleh karena itu, tingkat konsentrasi dan lamanya perlakuan harus benar-benar diperhatikan untuk mengurangi resiko kematian jaringan.

 

Penggunaan merkuri klorida (HgCl₂) telah terbukti efektif untuk sterilisasi bahan tanaman yang berasal dari lapangan. Meskipun demikian, penggunaan HgCl₂ merupakan pilihan terakhir jika bahan-bahan lain ternyata tidak mampu untuk memusnahkan mikroorganisme yang menginfeksi bahan tanaman. Hal itu dikarenakan sifat senyawa tersebut sangat beracun sehingga memerlukan penanganan yang sangat hati-hati. Jika menggunakan HgCL₂, sisa larutannya harus dikumpulkan dalam satu wadah kemudian dibuang di suatu tempat yang tidak akan mencemarkan sumber air minum.

 

Pada umumnya, jika eksplan yang digunakan agak keras dan cukup besar maka dapat segera disterilisasi dengan disinfektan. Pada kultur biji atau endosperm dewasa tanaman Euphorbiaceae, sterilisasi dilakukan terhadap seluruh biji atau biji-biji yang dikupas. Bila ovul, embrio, atau endosperm muda yang akan dikulturkan maka metode yang dipakai adalah mensterilkan ovari ataupun ovul dan mengambil eksplan di bawah kondisi aseptik sehingga jaringan inokulum yang lunak terlindungi dari pengaruh bahan sterilisasi yang bersifat racun. Sama halnya dengan kultur anther, tunas bunga disterilkan dan eksplan anther diisolasi secara aseptik.

 

Bahan sterilan cair perlu diperhatikan konsentrasinya dalam penggunaannya, sementara bahan sterilisasi padat perlu dilakukan penimbangan beratnya dan perlu dilarutkan terlebih dahulu ke dalam aquades steril sehingga dapat diperoleh sejumlah konsentrasi yang sesuai dengan ketentuan dalam proses sterilisasi eksplan (g/ml). Diketahui bahan sterilan yang perlu dilakukan penimbangan adalah fungisida, bakterisida, HgCl₂ dan Ca-hipoklorit.

Contoh:

a.    Fungisida dan bakterisida

- timbang bahan sebanyak 0,2 g

- larutkan dengan air steril 100 mL

- siap digunakan.

 

b.    HgCl₂

- timbang bahan sebanyak 0,05 – 0,1 g

- larutkan dengan 100 mL air steril lalu diaduk hingga larut dan merata

- tutup dengan plastik atau kertas steril (jangan menggunakan alumunium foil)

- siap digunakan.

 

c.    Ca-hipoklorit

- timbang bahan sebanyak 0,2 g

- larutkan dalam HCl 1 N secukupnya

- tambahkan air steril hingga volumenya 100 mL

- siap digunakan.

Sumber :  Modul diklat berbasis kompetensi bidang pertanian tanaman pangan, tanaman perkebunan dan hortikultura sub bidang kultur jaringan

SELEKSI BAHAN EKSPLAN

A.        Pengetahuan yang diperlukan dalam melakukan seleksi terhadap bahan eksplan

1)   Teknik produksi bibit dalam kultur jaringan

Perbanyakan bibit dengan menggunakan teknik kultur jaringan sering kali disebut mikropropagasi. Mikropropagasi diartikan sebagai perbanyakan tanaman dengan genotipe unggul menggunakan teknik kultur jaringan, tetapi teknik yang sering digunakan untuk produksi bibit tanaman ada tiga, yaitu :

A)  Teknik kultur tunas

Teknik kultur tunas yaitu perbanyakan tanaman dengan cara merangsang pertumbuhan (proliferasi) tunas aksiler atau lateral yang sudah ada pada eksplan. Teknik kultur tunas umumnya ada 4 tahap yaitu tahap inisiasi tunas, tahap multiplikasi tunas, tahap induksi perakaran dan tahap aklimatisasi.  Kultur tunas sering digunakan untuk produksi bibit secara komersial, karena lebih mudah dilakukan pada banyak jenis tanaman dan lebih menjamin kestabilan genetik pada bibit tanaman yang dihasilkan dibandingkan dengan teknik organogenesis ataupun embriogenesis somatik. Teknik kultur tunas untuk produksi bibit secara komersial dilakukan melalui dua cara, yaitu :

·            Proliferasi tunas

Prinsip proliferasi tunas adalah dengan meningkatkan jumlah pertumbuhan (proliferasi) tunas aksiler dan pada satu buah nodus dirangsang untuk tumbuh banyak tunas aksiler/lateral.  Teknik proliferasi tunas dapat dilakukan dengan cara : 1). mematikan dominansi apikal dengan cara memotong/mematikan tunas pucuk  serta menginduksi pertumbuhan tunas lateral dengan menggunakan zat pengatur tumbuh sitokinin pada media kultur dan 2). meletakkan eksplan dalam media secara horizontal. Contohnya pada mikropropagasi tanaman pisang, eksplan bonggol pisang dibelah dua secara vertikal, kemudian belahan bonggol tersebut ditanam secara horizontal untuk merangsang pertumbuhan tunas-tunas lateral.

 

·            Kultur nodus 

 

Prinsip kultur nodus adalah dengan menumbuhkan tinggi tunas hingga 5-10 cm tanpa cabang, mempunyai 4-5 nodus tunas, kemudian batang tunas tersebut dipotong-potong, dengan satu buah nodus (calon tunas) pada setiap potongan batang tersebut. Kultur nodus sangat penting untuk tanaman dengan tunas yang tumbuh tinggi dan sulit diinduksi tunas lateralnya dengan menggunakan sitokinin, seperti pada mikropropagasi tanaman kentang. 

 

B)  Teknik organogenesis 

Teknik organogenesis yaitu pembentukan tunas atau akar adventif baik inisiasi langsung dari eksplan maupun inisiasi dari jaringan kalus. Tunas ini tumbuh pada bagian tanaman yang tidak umum, seperti bagian daun, bagian batang antara nodus, kotiledon atau akar. Tunas adventif dapat langsung terbentuk dari jaringan eksplan, misalnya tunas tumbuh langsung dari bagian daun. Hal ini disebut teknik organogenesis langsung.

 

Ada pula tunas adventif tumbuh secara tidak langsung dari eksplan, dimana eksplan membentuk kalus terlebih dahulu kemudian dari kalus tersebut baru tumbuh tunas adventif. Hal tersebut disebut teknik organogenesis tidak langsung.

 

 

C)  Teknik somatik embryogenesis

Teknik somatik embryogenesis yaitu pembentukan embrio dari sel-sel somatik baik inisiasi langsung dari organ maupun inisiasi dari jaringan kalus. Sel-sel somatik pada teknik mikropropagasi ini akan berkembang melalui pembelahan sel dan membentuk embrio yang sama dengan embrio zigotik, yaitu mempunyai struktur bipolar yang terdiri dari  jaringan meristem tunas dan meristem akar. Embrio somatik ini dapat tumbuh secara langsung dari bagian eksplan atau secara tidak langsung yaitu melalui fase pembentukan kalus kemudian baru terbentuk embryo somatik pada kalus tersebut. Eksplan untuk teknik embriogenesis langsung adalah embrio zigotik yang belum matang karena jaringgannya bersifat embriogenik sehingga hanya memerlukan sedikit perlakuan ZPT untuk merubahnya menjadi emrio somatik.

 

 

2)   Tanaman induk

a.   Penanaman dan Pemeliharaan Induk pada Tanaman Pangan dan Hortikultura

Tanaman induk  adalah tanaman pilihan yang digunakan sebagai sumber bahan tanam/eksplan baik itu tanaman kecil ataupun tanaman besar yang sudah produktif yang berasal dari biji atau hasil perbanyakan vegetatif. Tanaman induk yang digunakan sebagai sumber bahan tanam/eksplan untuk produksi bibit secara kultur jaringan harus memenuhi persyaratan, yaitu :

·      memiliki sifat unggul dalam produktifitas dan ketahanan terhadap serangan organisme penggangu tanaman

·      nama varietas tanaman induk dan asal-usulnya (nama pemilik, tempat asal) harus jelas, sehingga memudahkan pelacakannya

·      tanaman induk memiliki nilai ekonomis agar biaya investasi alat dan biaya produksi bibit secara kultur jaringan yang cukup tinggi dapat cepat tercapai

·      ditanam di tempat yang terpisah dari tanaman lain yang dapat menjadi sumber penularan penyakit atau penyerbukan silang, terutama untuk tanaman induk yang dapat diperbanyak secara generatif.

Tanaman induk ditanam dan dipelihara di kebun induk yang yang terdiri dari beberapa varietas tanaman unggul untuk sumber penghasil bahan tanam/eksplan untuk perbanyakan dalam jumlah besar. Tanaman induk yang ditanam umumnya adalah tanaman hasil perbanyakan vegetatif (okulasi, sambung, susuan, cangkok, setek dan anakan) dan memenuhi persyaratan sebagai tanaman induk. Lokasi pohon induk sebaiknya tidak jauh dengan lokasi perbanyakan tanaman untuk memudahkan pelaksanaan perbanyakan bibit secara kultur jaringan.

 

Prinsip dasar penanaman tanaman induk adalah untuk memperoleh bahan tanam dari bagian tanaman dengan jaringan muda yang sedang aktif tumbuh sehingga diperlukan tahap pemudaan bahan tanam/eksplan. Hal ini dikarenakan jaringan tanaman yang masih muda mempunyai daya regenerasi yang lebih tinggi. Daya regenerasi yang tinggi disebabkan oleh sel-selnya yang masih aktif membelah diri dan relatif lebih bersih atau mengandung sedikit mikroorganisme kontaminan sehingga memudahkan dalam tahap sterilisasi.

 

Salah satu contoh tanaman hortikultura yang perlu dilakukan pemudaan sumber bahan tanam adalah pada tanaman induk pisang. Tanaman induk pisang yang dipilih sebagai pohon induk bisa berupa rumpun dewasa yang sudah berbuah dan menghasilkan anakan atau tanaman hasil kultur jaringan yang bonggolnya sudah berdiameter minimal 15 cm dan harus sehat dan bebas dari hama dan penyakit. Ukuran tunas pisang yang akan dijadikan bahan tanam sangat menentukan keberhasilan. Oleh karena itu, sebaiknya sebaiknya kultur jaringan tanaman pisang dimulai dengan bahan tanam yang muda dengan ukuran yang lebih kecil. Cara pemudaan bahan tanam pada induk tanaman pisang dapat dilakukan sebagai berikut :

1. Bonggol anakan pisang dewasa diambil dari tanaman induk dengan ukuran diameter bonggol antara 15  25 cm

2. Pelepah batang pisang dikupas hingga mencapai pelepah yang paling dalam lalu pucuk tunas bagian dalam dibuang memakai pisau

3. Bonggol anakan pisang ditanam dimedia dalam polibag besar, tetapi bagian bekas pucuk tunas muncul di permukaan tanah

4. Anakan-anakan baru yang muncul pada bonggol pisang digunakan untuk bahan tanam perbanyakan secara kultur jaringan

 

Tanaman induk pisang selama proses pemudaan bahan tanam/eksplan perlu dilakukan pemeliharaan antara lain :

·      bonggol pisang disemprot dengan fungisida dan bakterisida sebanyak 2 kali seminggu untuk menghindari pembusukan bonggol terlalu cepat

·      pemupukan menggunakan pupuk Urea diberikan untuk mempercepat pertumbuhan tunas baru pada bonggol pisang bonggol indukan pisang akan menghasilkan anakan baru selama 2 bulan dan setelah itu bonggol akan busuk sehingga harus dibuat bonggol indukan yang baru.

 

b.   Penanaman dan Pemeliharaan Induk pada Tanaman Perkebunan

Salah satu contoh tanaman perkebunan yang perlu dilakukan pemudaan sumber bahan tanam adalah pada tanaman induk kopi, kakao dan karet. Tanaman induk perkebunan yang dipilih sebagai pohon induk memiliki sifat unggul hasil perbanyakan secara vegetatif melalui stek atau cangkok dan dalam kondisi sehat dan bebas dari hama dan penyakit dengan cara sebagai berikut :

1. Pucuk tanaman diambil pucuk tanaman yan dorman atau masa inaktif pada pagi hari

2. Pucuk tanaman dipotong satu ruas sepajang 3-4 cm dengan menyisakan 1/2 potongan daunnya

3. Ujung potongan pucuk tanaman dicelupkan ke dalam paasta perangsang akar

4. Potongan bahan stek pucuk tanaman ditanam di media tanam dalam polibag

5. Hasil stek tanaman induk yang siap untuk dilakukan pemudaan tunas pucuk

6. Tanaman induk dilakukan pemudaan tunas pucuk melalui pemangkasan untuk merangsang pertumbuhan banyak tunas aksiler yang akan digunakan sebagai bahan tanam/eksplan

 

 

Tanaman induk yang dihasilkan kemudian ditanam pada polibag besar dan dipelihara dalam lingkungan yang terkendali, misalnya green house. Tanaman induk setelah mempunyai batang cokelat dan keras dilakukan pemangkasan pada pucuk tunasnya. Bekas potongannya diberi cat untuk mencegah batang menjadi kering dan menghindari masuknya mikro-organisme ke dalam jaringan tanaman induk. Pemotongan pucuk tunas dimaksudkan untuk merangsang pertumbuhan tunas aksiler yang akan digunakan sebagai bahan tanam/eksplan. Tunas aksiler biasanya akan tumbuh pada 2-3 minggu setelah pemotongan pucuk tunas. Tanaman induk diberi pemupukan NPK 15-15-15 dengan interval 2 minggu sekali untuk mempercepat dan meningkatkan jumlah pertumbuhan tunas aksilernya sebagai bahan tanam/eksplan.

 

Tanaman induk perkebunan selama proses pemudaan bahan tanam/ eksplan perlu dilakukan pemeliharaan di green house. Hal ini sangat menentukan keberhasilan proses pembuatan kultur aseptik tunasnya. Kondisi kebersihan dan kesehatan tunas tanaman induk yang akan diambil sebagai bahan tanam sangat menetukan tingkat kontaminasi pada hasil sterilisasi bahan tanam. Pucuk tunas tanaman perkebunan yang umumnya berkayu mempunyai karakter mudah sekali mengalami pencoklatan setelah disterilisasi. Oleh karena itu kondisi bahan tanam tunasnya yang benar-benar muda, bersih, dan bebas hama penyakit untuk meningkatkan keberhasilan sterilisasi bahan tanamnya sehingga tingkat kontaminasi jamur atau bakterinya kecil.

 

Pemeliharaan tanaman induk perkebunan yang perlu dilakukan untuk keberhasilan sterilisasi bahan tanamnya, antara lain :

·      penyemprotan fungisida dan bakterisida dilakukan sebanyak 2 kali seminggu pada saat tunas aksiler mulai tumbuh untuk menjaga tunas yang tumbuh terbebas dari penyakit jamur atau bakteri

·      perlakuan penyemprotan menggunakan insektisida Decis dengan dosis 2 ml/liter sebanyak 1-2 kali seminggu untuk menghindari serangan hama serangga seperti semut

·      dilakukan pemangkasan seluruh daun tanaman yang terkena serangan kutu putih lalu dilakukan penyemprotan menggunakan insektisida Confidor dengan dosis 1 ml/liter sebanyak 1-2 kali seminggu atau bergantung intensitas serangan hamanya

·      pemupukan menggunakan pupuk majemuk NPK 15-15-15 setiap 2 minggu sekali untuk meningkatkan jumlah pertumbuhan tunas aksilernya

 

 

3)   Jenis eksplan

Eksplan adalah bagian kecil jaringan atau organ yang diambil atau dipisahkan dari tanaman induknya sebagai bahan tanam in vitro kemudian dikulturkan secara in vitro dalam kondisi aseptis. Ada beberapa jenis eksplan yang dapat digunakan sebagai bahan tanam in vitro, yaitu :

A)    Eksplan biji biasanya digunakan untuk kultur biji (seed culture). Kultur ini biasanya dilakukan pada biji tanaman yang bersertifikat dan dipetik dari tanaman induk  yang sudah  diketahui  keunggulan sifatnya. Hal ini umumnya pada tanaman semusim yang organ tanamannya sangat sensitif terhadap bahan sterilan kimia. Selain itu biji juga dapat langsung dikecambahkan pada media agar-agar, contoh : biji anggrek yang tidak memiliki cadangan makanan.

 

B)     Eksplan organ, seperti : ujung akar, pucuk aksilar, tangkai daun, helaian daun, bunga, buah muda, dan buku batang, biasanya digunakan untuk kultur organ (organ culture). Eksplan organ tersebut biasanya digunakan untuk penanaman kultur melalui organogenesis (pembentukan organ tanaman secara langsung maupun tidak langsung) dan embriogenesis (pembentukan embrio tanaman secara langsung maupun tidak langsung). Selain itu akar biasanya digunakan dalam hairy root culture yaitu kultur dari eksplan akar untuk memproduksi bahan metabolit sekunder dari akar tanaman.

 

C)    Eksplan bagian reproduktif tanaman, seperti : kepala sari (anther), tepungsari (pollen), dan bakal buah (ovule) biasanya digunakan untuk kultur haploid (haploid culture). Eksplan tersebut digunakan dalam kultur untuk menghasilkan tanaman haploid (haploid culture), melalui kultur eksplan anter (anther culture), kultur eksplan polen (pollen culture), dan kultur eksplan ovul (ovule culture).

 

D)    Eksplan protoplas tanaman yang digunakan untuk kultur protoplasma (protoplast culture). Eksplan tersebut berupa sel yang telah dilepas bagian dinding selnya menggunakan bantuan enzim. Protoplas diletakkan pada media padat dibiarkan agar membelah diri dan membentuk dinding selnya kembali. Kultur protoplas biasanya untuk keperluan hibridisasi somatik atau fusi sel soma (fusi 2 protoplas baik intraspesifik maupun interspesifik).

 

 

4)   Kriteria eksplan

Ada beberapa kriteria yang harus dipertimbangkan dalam seleksi bahan tanam/eksplan. Kriteria-kriteria tersebut akan sangat menentukan berhasil atau tidaknya pengkulturan bahan tanam/eksplan yang meliputi :

A) Ukuran bahan tanam/eksplan

Ukuran bahan tanam/eksplan dapat berpengaruh terhadap keberhasilan kultur jaringan. Bahan tanam/eksplan yang berukuran besar beresiko kontaminasi lebih besar dibandingkan eksplan berukuran kecil, tetapi kemampuan hidupnya lebih besar dan tumbuhnya lebih cepat. Contohnya eksplan tunas muda beresiko kontaminasi lebih tinggi dibandingkan eksplan jaringan meristem tunas, tetapi tunas lebih mudah dan cepat tumbuh beregenerasi dibandingkan jaringan meristem yang biasanya tumbuh lebih lambat untuk beregenerasi menjadi tanaman utuh kembali.

 

B) Umur fisiologis bahan tanam/eksplan

Bagian tanaman yang digunakan sebagai bahan tanam/eksplan umumnya adalah jaringan muda yang sedang tumbuh aktif. Hal ini dikarenakan mempunyai daya regenerasi yang lebih tinggi, sel-selnya masih aktif membelah diri dan relatif lebih bersih (mengandung sedikit mikroorganisme kontaminan) sehingga mudah disterilisasi. Jaringan yang sudah tua lebih sulit beregenerasi dan biasanya lebih banyak mengandung mikroorganisme kontaminan.

C) Umur ontogenetik tanaman induk (sumber eksplan)

Umur ontogenetik tanaman induk sumber bahan tanam/eksplan sangat mempengaruhi keberhasilan penanaman eksplan. Eksplan yang diambil dari tanaman induk yang masih muda umumnya lebih mudah beregenerasi dibandingkan eksplan yang diambil dari tanaman induk yang sudah dewasa, walaupun jaringan yang diisolasi secara fisiologis masih muda. Contohnya induksi tunas dari eksplan tunas muda dari tanaman induk berupa pohon dewasa, biasanya akan memerlukan waktu yang lebih lama dibandingkan induksi tunas dari eksplan tunas yang diambil dari bibit tanaman yang baru disemai di polibag (tahap pemudaan eksplan).

5)   Pemilihan bahan eksplan

Beberapa hal yang harus dipertimbangkan dalam memilih eksplan adalah kualitas/kesehatan tanaman, musim saat pengambilan eksplan, status fisiologi dan genotip, asal lokasi tanaman, jenis organ/jaringan, dan tujuan pemanfaatan kultur. Tanaman yang sehat mengurangi resiko kegagalan pertumbuhan maupun terjadinya kontaminasi. 

Umur tanaman menentukan kondisi fisiologis tanaman. Umur fisiologis atau fase pertumbuhan tanaman sangat berpengaruh terhadap respon pertumbuhan in vitro. Pada prinsipnya jaringan meristematik dan jaringan yang masih mampu mengalami dediferensiasi memiliki respon pertumbuhan in vitro  yang lebih baik dibanding jaringan yang sudah dewasa. Ujung tunas dan bagian nodus umumnya menghasilkan regenerasi tunas aksilar dan akar lebih cepat. Tanaman yang sedang dalam masa dorman sebaiknya tidak digunakan sebagai eksplan kecuali sudah mencapai masa pemecahan dormansi. Sedangkan untuk tanaman hutan fase juvenil merupakan fase yang dianjurkan untuk digunakan sebagai sumber eksplan.

Variasi pilihan jenis eksplan juga tergantung tipe respon pertumbuhan yang diinginkan. Jika kultur bertujuan untuk propagasi maka eksplan yang digunakan biasanya adalah kuncup atau tunas lateral atau terminal. Induksi kalus dapat menggunakan eksplan kotiledon, hipokotil, batang daun, atau embrio. Jaringan daun banyak digunakan untuk isolasi protoplas. Eksplan sebagai bahan awal menghasilkan kuncup adventif baru yang diambil dari tanaman yang secara alami mempunyai kemampuan regenerasi tinggi, misalnya Begonia cukup digunakan sebagian kecil batang, daun maupun akar. Tetapi tanaman-tanaman lain yang kemampuan perkembangan kuncup adventifnya rendah dapat menggunakan eksplan tunas yang terdapat pada ujung batang utama (tunas pucuk) atau pada cabang (tunas aksilar).

6)   Penandaan hasil seleksi bahan eksplan

Hasil seleksi bahan eksplan dapat diberi nomor berdasarkan kodefikasi yang berlaku di masing-masing tempat (laboratorium/perusahaan). Kodefikasi ini berfungsi untuk memudahkan pengorganisasian bahan eksplan yang dikumpulkan. Penataan wadah bahan ekaplan (cawan petri, botol, kantong plastik) dapat diatur berdasarkan jenis tanaman, kultivar, jenis bahan eksplan, dan perlakuan khusus lainnya. Pengelompokkan diperlukan agar tidak terjadi kekeliruan pada tahap selanjutnya. Wadah bahan eksplan (cawan petri, botol, kantong plastik) diatur dengan jarak antar wadah tidak terlalu rapat dan jumlah disesuaikan tergantung kapasitas tempat penyimpanan.

Sumber  :  Modul diklat berbasis kompetensi bidang pertanian tanaman pangan, tanaman perkebunan dan hortikultura sub bidang kultur jaringan